Thread by @kkkkkkk777

❣️イベルメクチンの新しい作用機序の論文❣️

イベルメクチンは KPNA2 を抑制することにより HBV の核への侵入を阻害する

名古屋市立大学
北里大学大村智記念研究所
熊本大学

2022年11月8日 Viruses

mdpi.com/1999-4915/14/1…

#イベルメクチン

概要
B 型肝炎ウイルス (HBV) は、ヒトの肝細胞に特異的に感染し、肝硬変や肝がんのリスクを高めます。現在、核酸アナログは、HBV 感染によって引き起こされる慢性肝炎の主な治療法です。

#イベルメクチン

核酸類似体は、HBV 逆転写酵素を阻害することによって HBV DNA を排除できますが、共有結合閉環状 DNA (cccDNA) および B 型肝炎表面抗原 (HBsAg) の負の変換を引き起こすことはできません。

#イベルメクチン

本研究では、抗フィラリア薬イベルメクチンが、核酸アナログのエンテカビルやNa +とは異なるメカニズムでHBV産生を抑制することを明らかにしました。

#イベルメクチン

イベルメクチンは、HBV 感染ヒト肝細胞癌細胞 (HepG2-hNTCP-C4 細胞) およびヒト化マウス肝細胞 (PXB 肝細胞) において、HBsAg を含むいくつかの HBV マーカーのレベルを低下させました。

#イベルメクチン

さらに、イベルメクチンは、HepG2-hNTCP-C4 細胞の核における HBV コアタンパク質と核輸送体カリオフェリン α2 (KPNA2) の発現を有意に減少させました。さらに、KPNA1-6 の枯渇は cccDNA の産生を抑制した。

#イベルメクチン

これらの結果は、KPNA1-6 が HBV の核移行に関与しており、イベルメクチンが KPNA2 を阻害することによって HBV の核移行を抑制することを示唆しています。この研究は、B 型肝炎の新しい治療法としてのイベルメクチンの可能性を示してい ます。

#イベルメクチン

本文より抜粋

3. 結果
3.1. イベルメクチンは HepG2-hNTCP-C4 細胞の HBV 感染を阻害する
HBV マーカーを使用して、HepG2-hNTCP-C4 細胞の HBV 感染に対するイベルメクチンの効果を調べました。HBV 感染の 1 日前から開始して 48 時間、細胞をイベルメクチン (図 1 A) に曝露し、

さまざまな HBV マーカーと細胞生存率について分析しました (図 1 B)。培養上清中の HBV DNA と HBsAg の両方のレベルは、時間依存的にイベルメクチンへの曝露によって大幅に減少しました (図1C)。

9 dpi で、イベルメクチンは HBcrAg および cccDNA レベルをそれぞれコントロールの 54% および 61% に減少させ (図 1 D、E)、濃度依存的に HBsAg レベルを減少させました (図 1 F)。さらに、イベルメクチン処理後に細胞毒性は観察されませんでした (図1G)。

3.2. PXB 肝細胞の初期 HBV感染におけるイベルメクチンの抗 HBV 効果
PXB肝細胞を使用して、イベルメクチンの抗HBV効果が正常なヒト肝細胞でも観察されるかどうかを確認しました。同様に、図 1に示されているように、PXB 肝細胞を HBV 感染の 1 日前から開始して 48 時間イベルメクチンに曝露すると、

培養上清中の HBV DNA および HBsAg レベルの両方が時間依存的に減少し、13 で HBcrAg および cccDNA のレベルが大幅に減少しました。 dpi (図 2 A–E)。さらに、PXB 肝細胞ではイベルメクチンによる細胞毒性は観察されませんでした (図 2 F)。

これらの結果は、イベルメクチンが肝細胞癌細胞と正常なヒト肝細胞の両方で抗 HBV 効果を発揮することを示唆しています。

3.3. イベルメクチンは新規メカニズムにより HBV 感染を阻害します

イベルメクチンが、逆転写酵素や NCTP を介した HBV 侵入の阻害など、前述のメカニズムを示すかどうかを調査しました。

テトラサイクリンの非存在下での 4 日間の ETV への Hep38.7-Tet 細胞の曝露は、対照所見と比較して HBV DNA の産生を有意に減少させました (図 3A )。ただし、イベルメクチンへの曝露は、HBV DNA 産生に影響を与えませんでした。

次に、イベルメクチンまたはCsAを用いた preS1 結合アッセイを使用して、イベルメクチンが NCTP を介したHBV侵入を阻害するかどうかを調べました。CsAは NTCPに結合し、NTCP と HBV エンベロープタンパク質の PreS1 領域との間の相互作用を阻害することで、肝細胞への HBV の侵入を抑制します [ 54 ]。

CsAで3時間処理すると、preS1タンパク質のHepG2-hNTCP-C4細胞への侵入が有意に阻害されました(図 3 B)。しかし、イベルメクチンはコントロールと同程度に細胞内にpreS1タンパク質の蓄積を誘導した。

さらに、preS1インターナリゼーションアッセイを実行して、イベルメクチンがHBVのNTCPへの結合だけでなく、その後の取り込みにも影響を与えるかどうかを調査しました（図S1）。

preS1 インターナリゼーション アッセイでは、preS1-TAMRA を 4 °C (4 °C ステップ) で細胞表面に付着させた後、37 °C (37 °C ステップ) で preS1-TAMRA を細胞内に取り込みました。CsAを4°Cのステップから添加すると、preS1結合が阻害され、preS1-TAMRAの細胞取り込みが減少しました（図S1A）。

あるいは、イベルメクチンは、4 °C または 37 °C のステップから添加した場合、コントロールと同程度の preS1-TAMRA の細胞内取り込みを示しました (図S1A、B）。

これらの結果は、イベルメクチンが、逆転写酵素および肝細胞への HBV 侵入の阻害以外の異なる機序によって HBV 産生を阻害することを示唆しています。

3.4。イベルメクチンは HBc の核移行を阻害する

pCMV-HBcをトランスフェクトした HepG2-hNTCP-C4細胞を使用して、HBVの核移行に重要な役割を果たす HBc の細胞内局在がイベルメクチン処理によって変化するかどうかを調べました。核および細胞質タンパク質は適切に分画および抽出されました（図S2A）。

免疫染色は、対照の効果と比較して、HBcの核局在化がイベルメクチンによって有意に阻害されたことを示した(図4Aおよび図S2B )。また、Simple Westernアッセイを使用して、核および細胞質画分のHBcタンパク質の量を分析しました。

結果は、イベルメクチンが核画分の HBc 含有量を大幅に減少させることを示しました (図 4B）。したがって、これらの結果は、イベルメクチンが HBc の核移行を阻害することによって HBV 産生を抑制することを示唆しています。

3.5。イベルメクチンは KPNA2 の核局在化を減少させる

現在までに、インポーチンαの 7 つのサブタイプがヒトで発見されており、それらは KPNA1-7 と呼ばれています[ 33、34 ]。しかし、ヒト肝細胞における各サブタイプの発現と、イベルメクチンによって阻害されるサブタイプは不明です。

したがって、HepG2-hNTCP-C4細胞およびPXB肝細胞におけるKPNA1-7およびKPNB1の発現と、インポーチンα/β発現に対するイベルメクチンの影響を調査しました。遺伝子発現パターンは HepG2-hNTCP-C4細胞と PXB 肝細胞の間で異なっていましたが、KPNA1-6 とKPNB1は両方の細胞株で発現していました (図 5 A)。

特に、KPNA2、KPNA6、および KPNB1 は、PXB 肝細胞よりも HepG2-hNTCP-C4 細胞で高発現していました。逆に、KPNA7 はどちらの細胞株でもほとんど発現していませんでした。

イベルメクチンとインポーチンの相互作用を調べるために、核内の KPNA1-6 と KPNB1 のタンパク質発現をイベルメクチン処理後に測定しました。核および細胞質タンパク質は適切に分画および抽出されました（図S2C）。

結果は、核内の KPNA2 発現がイベルメクチンによって有意に減少したことを示しました (図 5 B)。ただし、KPNA2 以外の KPNA サブタイプの核内発現には有意差は示されませんでした。これらの結果は、イベルメクチンが KPNA2 の核内局在を阻害することを示唆しています。

3.6. Importin α の複数のサブタイプが HBV 感染に関与している

インポーチンのどのサブタイプが HBV 感染に関与しているかを判断するために、各インポーチンを枯渇させた後、細胞に HBV を感染させました。

siRNAによる標的インポーチン遺伝子（KPNA1-6およびKPNB1）の特定の枯渇が確認されました（図S3A）。KPNA1–6の枯渇では細胞毒性は観察されませんでしたが、siRNAトランスフェクション後の日数が増加するにつれて、KPNB1の枯渇では細胞死が観察されました（図S3B）。

各 KPNA サブタイプの枯渇は、対照群の所見と比較して cccDNA の産生を大幅に減少させました (図 6 A)。さらに、KPNA1、KPNA2、KPNA4、および KPNA6 を枯渇させると、対照と比較して培養上清中の HBsAg レベルが大幅に低下しました (図 6B）。

しかしながら、ＫＰＮＡ３の枯渇はＨＢｓＡｇレベルを上昇させた（図６Ｂ）。KPNB1 の枯渇により、細胞死により HBsAg レベルが大幅に低下しましたが、cccDNA レベルは大幅に増加しました (図 6 A、B)。

KPNB1 と HBV 感染をさらに調査するために、HBV に感染した HepG2-hNTCP-C4 細胞を、KPNB1 の特異的阻害剤であるインポータゾールに曝露しました。

しかし、HBsAg レベルは低下しませんでした (図6C)。これらの結果は、KPNB1 ではなく KPNA が主に HBV 感染に関与しており、KPNA1、KPNA2、KPNA4、および KPNA6 の抑制も HBV 複製を阻害することを示唆しています。

4。議論

これは、イベルメクチンが HBV 感染を抑制し、イベルメクチンがインポーチン α/β を阻害することによって HBc の核移行を阻害する可能性があることを示した最初の報告です。

イベルメクチンは、HIV やデングウイルスなどの RNA ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの DNA ウイルスを抑制することが以前に報告されていました [ 42 , 55 ]。

イベルメクチンがこれらのウイルスを抑制するメカニズムは、宿主由来のインポーチン α/β 複合体を阻害することで、NLS を運ぶウイルスが核に侵入するのを防ぎます [ 42 ]。

この研究では、イベルメクチンが in vitro で HBV 感染を抑制し、抑制効果は主にインポーチン α1 (すなわち、KPNA2) の阻害に基づいていることがわかりました。

研究結果は、イベルメクチンが cccDNA の蓄積を抑制することによって HBV 産生を阻害できることを示唆しており (図 1 C–F)、さらなる分析により、その効果が細胞増殖の阻害に関連していないことが示されました (図 1 G)。

PXB肝細胞を用いた結果は、イベルメクチンがヒト肝細胞癌細胞と正常なヒト肝細胞の両方に対して抗HBV効果を発揮し、細胞毒性を引き起こさないことを示しました（図2）。

さらに、ETV および CsA とは異なり、イベルメクチンによる抗 HBV 効果のメカニズムは、HBV DNA 複製の阻害および NTCP を介した肝細胞への侵入とは無関係でした (図 3および図 S1）。

これらの結果は、イベルメクチンが ETV や CsA とは異なる新しいメカニズムによって HBV の複製を阻害することを示しています。あるいは、3 dpi でのコントロールとイベルメクチン処理の間で、HBV DNA および HBsAg レベルに有意差はありませんでした (図 1 C および図 2 B、C)。

cccDNA は感染後 3 日間かけて徐々に産生されることが報告されている [ 56 ]。3 dpi での有意差の欠如は、感染の非常に初期段階でのイベルメクチンによる HBc 核侵入の弱い阻害ではなく、培養上清で新たに生成された HBV マーカーが検出限界を下回ったためである可能性があります。

HBcタンパク質によって構成されるヌクレオキャプシドは、HBVの核移行に関与しています。インポーチン α/β は HBc の核侵入に関与することが報告されており [ 32 ]、イベルメクチンはインポーチン α/β を阻害すると報告されている [ 42 ]。

この研究では、HBcの核内蓄積がイベルメクチンによって有意に減少したため（図4）、イベルメクチンはインポーチンα/βによってHBcの核移行を阻害することが予測されました。ただし、この研究で適用された HBc には HBV ゲノムが含まれておらず、元の HBV とは異なる細胞内挙動を示す可能性があります。

したがって、イベルメクチンが HBV ゲノムを含むシステムで HBc の核移行を阻害するかどうかを調べることも必要です。

次に、肝細胞におけるイベルメクチンとインポーチンの相互作用、およびインポーチンとHBV感染との関連を調査しました。イベルメクチンは、HepG2-hNTCP-C4 細胞の核における KPNA2 の蓄積を有意に阻害しました (図 5 B)。

逆に、KPNA6 は HepG2-hNTCP-C4 細胞で 2 番目に豊富に発現するインポーチン α サブタイプであったにもかかわらず、イベルメクチン曝露は KPNA6 の発現に影響を与えませんでした (図 5）。したがって、イベルメクチンは、KPNA サブタイプの発現レベルに関係なく、KPNA2 の核内局在を阻害できます。

核インポーチンの発現のみを解析したので、イベルメクチンが HBc の代わりにインポーチンに結合して核内に入る可能性は否定できません。イベルメクチンの作用機序は、インポーチンαのNLS結合ポケットへの結合によるものであると報告されている[ 42]。

したがって、この研究で核発現に有意差がなかった KPNA2 を除くインポーチンも、イベルメクチンによる HBV 核侵入の阻害に関与している可能性があります。

イベルメクチンがインポーチンと細胞質内 HBc の結合を減少させるかどうかを判断するには、AlphaScreenアッセイまたはアポトーシスタンパク質依存性タンパク質消去剤 (SNIPER) の特異的および非遺伝的阻害剤を使用した化学タンパク質ノックダウン技術を使用したさらなる調査を実施する必要があります。

この研究では、各 KPNA 遺伝子の枯渇により cccDNA 産生が大幅に減少し、HBV ヌクレオキャプシドの核輸送を含む cccDNA 産生までの HBV 感染プロセスに KPNA が関与していることが示唆されました (図 6 A)。

KPNA1–6およびKPNB1の枯渇がHBc核移植に及ぼす影響はまだ調べていませんが、これにより、cccDNAのレベルの低下に関するより詳細な洞察が得られます。対照的に、HBsAg 産生は、KPNA1、KPNA2、KPNA4、および KPNA6 の枯渇によって大幅に減少しましたが、

KPNA3 の枯渇は、cccDNA 産生の有意な減少にもかかわらず、HBsAg 産生の有意な増加をもたらしました (図 6A、B)。cccDNA の産生は HBc の核輸送に依存している可能性が高いが、HBsAg の産生は cccDNA の産生とそれに続く転写などの HBV 複製メカニズムに依存している [ 57 ]。

KPNA3 は NF-κB シグナル伝達の活性化に関与しており、KPNA3 の枯渇は抗ウイルス遺伝子発現の抑制を介してウイルス複製を促進すると報告されている [ 58 ]。したがって、この研究では、同じメカニズムがHBsAgの産生増加に関与していると仮定しました。

KPNA6 の枯渇は、他の KPNA サブタイプの枯渇よりも cccDNA と HBsAg の産生をより強力に抑制しました (図 6 A、B)。KPNA6 は、インフルエンザウイルス複製の正の調節因子として同定されている [ 59]。

ＫＰＮＡ６の核移行に対するイベルメクチンの阻害効果は弱かったが（図５Ｂ）、抗ＨＢＶ効果は、ＫＰＮＡ６に対するイベルメクチンの結合特異性を増強することによって増加する可能性がある。さらに、KPNA1-6が枯渇した細胞では細胞毒性は観察されませんでした（図S3B）。

これは、1 つの KPNA サブタイプが機能しない場合に、他のサブタイプが補うためである可能性があります。実際、各 KPNA サブタイプのノックダウンは、イベルメクチンよりも有意に HBV を抑制せず、非トランスフェクト細胞と比較して有意差は観察されませんでした (図 6 A、B)。

以前に、HIV-1 が KPNA の複数のサブタイプを介して核に移行することが報告された [ 60]。したがって、複数のKPNAサブタイプが同様にHBV感染に関与しており、ノックダウンKPNAを除く他のKPNAがHBV核移行を補完し、それによってcccDNA産生の阻害効果を弱めている可能性があると考えました。

図5および図6の結果は、イベルメクチンが KPNA2 を阻害することによって抗 HBV 効果を発揮し、それによって HBc および HBV 複製に関与する因子の核内輸送を抑制することを示唆しています。KPNA2の過剰発現とイベルメクチンの減弱効果の確認は、この発見をより詳細に理解するのに役立つかもしれません.

さらに、KPNB1 の枯渇は HBsAg 産生を大幅に減少させましたが、cccDNA 産生を大幅に増加させました (図 6 A、B)。細胞死は、KPNB1の枯渇でのみ観察されました（図S3B）。

インポーチンβは、転写因子などのシグナル伝達分子の核内輸送において、単量体として、またはインポーチンαなどのアダプターとのヘテロ二量体として中心的な役割を果たします [ 29 ]。

以前の研究では、KPNB1 の枯渇は、核への KPNB1 の移動効率を低下させることによって細胞死を誘発することが報告された [ 61 ]。したがって、KPNB1の枯渇により細胞の生存が阻害され、培養上清中のHBsAgの量が減少した可能性があります。

さらに、KPNB1 の枯渇は、いくつかの KPNA サブタイプの発現を増加させました (図 S3A )。以前の研究では、インポーチン β の量は感染などの特定の条件によって制限されるため、インポーチン α は単独で核に移行すると推測されていた [ 62 ]。

KPNB1の枯渇を補うためにKPNA発現が促進され、KPNAがHBV感染を促進し、cccDNAレベルと細胞毒性が増加した可能性があります。あるいは、KPNB1 ノックダウンは、HBV 複製細胞である HepDES19 細胞からの cccDNA 産生を減少させたと報告されている [ 63]、これは私たちの研究結果と矛盾していました。

これにより、HepG2-hNTCP-C4細胞とHepDES19細胞の特性の違いにより、KPNB1の枯渇により細胞毒性とHBV感染が増加した可能性があると推測しました。HBV 感染と KPNB1 の関連性をさらに調査するために、インポータゾールの抗 HBV 効果を分析しましたが、

驚くべきことに、イベルメクチンに必要な濃度よりも 5 倍高い濃度でも HBV 感染を抑制できませんでした (図6C および図 S4 )。

私たちの研究では、cccDNA 産生は KPNB1 枯渇によって減少せず、HBsAg 産生はインポータゾールによって阻害されませんでした (図 6 A、C)。これは、HBV がインポーチン β なしで核に輸送されることを示唆しています。

5。結論

私たちの結果は、イベルメクチンが肝細胞のKPNA2を阻害することにより、cccDNAやHBsAgなどのHBV関連マーカーの産生を減少させたことを示しています。この研究は、HBV 治療におけるイベルメクチンの新たな可能性を示しています。