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Indy (I'm Not Dead yet) @indy_yet
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Je suis en train de faire un marquage tétramère (enfin Dextramer™) pour aller à la pêche aux lymphocytes T spécifiques de protéines tumorales : déjà 140 Mio de données en un tube (2 milliards de cellules analysées)...!
Ça intéresse qqun un thread sur le concept ?
Alors à la demande générale (nan j'déconne ;) : @NuclearYoshi & @jfberdah) je vais tenter de vous expliquer comment on arrive à retrouver au sein d'une tumeur les cellules immunitaires qui sont les plus à même de la détruire.
Tout d'abord : qu'est ce qu'une tumeur ? (@jfberdah va me maudire de le tagger avec le BA-B.A. !)

Une tumeur cancéreuse dans notre cas, c'est pour simplifier, une masse qui contient 1/ des cellules tumorales 2/ des cellules stromales 3/ des cellules immunitaires (le + souvent)
1/ alors là c'est simple : ce sont des cellules qui ont perdu le contrôle de leur cycle de vie (il y a des gènes "interrupteurs") et se divisent souvent rapidement. En plus elles envahissent l'organe où elles sont nées, et finissent par en sortir pour aller métastaser ailleurs.
Ces cellules elles arrivent à cet état parce qu'elles ont subi des mutations : leur génome (= ensemble de leur ADN, patrimoine génétique) a subi des altérations à la suite de processus physiologiques (respiration), ou induits par l'environnement (UV).
Crédit : @pedromics
Comme ces processus sont omniprésents, nous avons toustes des cellules cancéreuses en nous à un instant t. La plupart, cependant, vont mourir : soit parce qu'elles sont en réalité inadaptées à leur environnement à cause de la mutation subie.
D'autres survivent !
Revenons à la composition d'une tumeur. 2/ Le stroma (lit en grec) : les vaisseaux, les cellules qui forment le collagène (matrice extracellulaire pour les connaisseur-euses)...
Une tumeur a besoin de dioxygène et de nutriments. Elle ne peut pas survivre sans.
Aussi, soit les cellules cancéreuses parviennent, en se multipliant, à faire suivre le réseau de distribution de distribution de "fluides" (créer des vaisseaux sanguins donc), soit, faute d'énergie, pfuit !
Enfin, 3/ restent les cellules immunitaires.
Des cellules qui se multiplient et essaient de survivre (et meurent en partie) face au manque de nutriments, ça fait du désordre. En langage scientifique, on dira de l'inflammation.
Cette inflammation c'est un vrai signal d'alarme : ça attire l'attention des cellules immunitaires du sang qui pénètrent la tumeur.
Sauf que : les tumeurs sont un peu ce mec égoïste qui en a rien à faire des autres. Il veut perdurer à tout prix d'ailleurs.
Aussi, naturellement, la plupart des tumeurs deviennent capables de tempérer les ardeurs des cellules qui arrivent : main basse sur le garde manger (une cellule immunitaire ça bouffe aussi), et mensonges (envoi de signaux immunosuppresseurs).
Néanmoins, il est rare que ces approches empêchent totalement les cellules présentatrices d'antigène (antigènes = les morceaux de protéines de cellules cancéreuses, souvent anormaux à cause de mutations) d'attraper des antigènes tumoraux et de remonter l'information !
Pour ce faire, nos vaillantes cellules présentatrices d'antigène doivent sortir de la tumeur par des portes dérobées (les vaisseaux lymphatiques) vers les QG du système immunitaire : les ganglions lymphatiques.
Là, elles vont attendre leur promise : une cellule T spécifique.
En effet, les antigènes de la tumeur ne sont pas reconnus par toutes les cellules T. Seules quelques unes dans l'organisme sont en capacité de répondre.
(interruption momentanée de nos programmes)
(reprise)
Heureusement, nos lymphocytes T non activés ("naïfs") circulent entre le sang, les ganglions, la rate...
Donc la probabilité qu'ils rencontrent la cellule présentatrice de l'antigène tumoral est non nulle !
À cette heureuse occasion, la cellule présentatrice aura apprêté son antigène tumoral sur le Complexe majeur d'histocompatibilité qu'elle porte sur elle (CMH, une sorte de présentoir à antigène).
De son côté, notre naïf lymphocyte T, sort ses récepteurs T (ou TCR) sans problème...

La cellule présentatrice, bien apprêtée, lui fait son show.
Antigène, signaux de stimulation... Le lymphocyte T ressort tout émoustillé de cette première expérience de l'antigène défendu.
Maintenant qu'il est activé, le jeune lymphocyte T va reprendre la route (imaginez le ganglion lymphatique comme un motel) du sang.
Puisque le site tumoral est inflammatoire, au hasard de son road trip il est probable que le lymphocyte T finisse par arriver ds le stroma tumoral
Imaginez le réseau de vaisseaux d'une tumeur comme une autoroute pleine d'entrée et de sorties : ça fuit de partout, et le débit est très très mauvais. Ces embouteillages font que les lymphocytes T ont du temps pour sortir du vaisseau.
Là, plusieurs cas de figure existent : soit la zone est interdite à la circulation par arrêté municipal et led lymphocytes T restent en périphérie de la tumeur, impuissants.
Soit non, et ils rentrent et.....
.... Ça canarde sec !
Mes cellules tumorales, reconnues par le biais de leurs antigènes, se font dégommer par les lymphocytes T spécifiques activés.
Au moins un temps – une tumeur va naturellement résister, bien souvent.
Mais c'est une autre histoire.
Quoi qu'il en soit, quasiment aucun.e patient.e avec un cancer ne survit à long terme sans ces réponses spécifiques anti tumorales. Même partiellement inefficaces, elles permettent un contrôle local (et à distance si des métastases existent déjà)
Re interruption momentanée pour dîner :)
De retour !

Alors, les lymphocytes T spécifiques de la tumeur que reconnaissent-ils exactement de si spécifique ?
Les antigènes spécifiques de tumeurs peuvent être séparés en 3 catégories : 1/ ceux qui ne devraient pas être là, 2/ ceux qui sont bien trop présents pour être honnêtes, 3/ ceux qui ressemblent à une protéine normale, mais qui ont une sale tronche....
D'abord, les 3/. Il s'agit de protéines issues des gènes mutés ! Le plus connu peut être, c'est B-raf souvent muté dans une tumeur de la peau due aux UV, le mélanome. Il en existe d'autres ( (T)P53 par exemple, la gardienne de notre génome).
La catégorie 2/ est représentée par les HER2 et autres EGFR. Ces gènes servent de signaux de croissance. En temps normal, ils disent à nos cellules de survivre (eh oui, une cellule a besoin qu'on la soutienne moralement...)
Les cellules sont addicts a ces petits gestes d'amour...
Et....les créent s'il n'y en a pas assez !
Les cancers du sein HER2+ ou les tumeurs du poumon EGFR+ expriment beaucoup ces antigènes pour s'auto-sustenter. Le "vaccin" thérapeutique cubain essaie de favoriser l'émergence de lymphocytes T spécifiques de l'EGF par exemple.
Enfin...1/. Pendant notre vie fœtale, nous utilisons plein de gènes, désactivés à l'âge adulte, dans les cellules adultes. Il s'agit des antigènes carcino-embryonnaires (CEA), de gènes testiculaires, de la télomérase (aka l'enzyme qui reprise nos chromosomes !)...
On a identifié de nombreux antigènes dans toutes ces catégories mais il est quasi impossible (hors télomérase) d'en trouver un commun à tous les cancers 😔
Plus vous avez des réponses immunitaires variées contre divers antigènes tumoraux, mieux c'est !
Bon ! Venons en à la technique !
Comment trouver les lymphocytes T spécifiques dans une tumeur... 🤔
Déjà, il faut du matériel tumoral !

Observez ici un mélanome de type nodulaire (B-raf muté) qui a poussé sous la peau, jusqu'à la abdominale.
On voit bien les néovaisseaux qui alimentent la tumeur.
La tumeur (humaine ou animale) est prélevée et mixée dans une sorte de blender high tech, avec des enzymes (qui vont déliter le tissu) et libérer les cellules tumorales, stromales et immunitaires.
La soupe ainsi obtenue est dans ce cas un magma noirâtre.
Afin d'en retirer les cellules tumorales, on fait subir une centrifugation (= on fait tourner dans un tube, à 2000 rotations/minute) aux cellules, ds un liquide qui les sépare (le Percoll – un sucre complexe). Résultat ⤵️
Après avoir aspiré précautionneusement l'anneau blanchâtre de globules blancs (TIL sur la photo) avec une pipette, on s'est débarrassé de ce qui ne nous intéresse pas.
La suite demain avec les détails de la pêche aux lymphocytes T spécifiques ! :-)
Les graphiques de ma manip sont au labo !
Allez, un café et on repart dans le monde merveilleux de l'immuno-oncologie.

Nous en étions resté·es à une soupe de cellules immunitaires, purifiées par centrifugation à partir de la tumeur.
C'est là que sont le + probablemt localisées nos soldats lymphocytes T spécifiques.

Mais comment, de manière simple, les retrouver ds un ensemble hétéroclite contenant :
• granulocytes (ou polynucléaires)
• macrophages et cellules présentatrices
• lymphocytes divers (NK, B..)
J'espère que ce sera lisible mais voici un petit aperçu de ce que l'on peut trouver dans une tumeur.
Le paysage est varié n'est ce pas ?

Quoi qu'il en soit, si l'on veut simplement trouver des lymphocytes T spécifiques connus, la tâche est relativement facile !
On prend une aliquote (= échantillon) de tout ce beau monde après l'avoir bien remué.
Ça c'est mes tumeurs avant purification, mais après mixage. J'avais oublié l'illustration perso ;)
Le tout est servi frappé, c'est meilleur 🍹
Bref ! Maintenant qu'on a un échantillon, on va essayer de mettre une identité sur nos protagonistes.
Pour ce faire on a ces petits gars-là :
Les anticorps, puisque c'est eux dont s'agit, reconnaissent des antigènes.
Ds notre cas, les cellules immunitaires en ont tout plein de manière normale à leur surface.
Cette "carte d'identité" = la présence ou l'absence de "clusters de différenciation", CD[1 à 3 chiffres]
Par exemple, nos copains lymphocytes T sont divisés en :
• CD45+ CD3+ CD4+
• CD45+ CD3+ CD8+
pour l'essentiel.
CD45 identifie formellement la plupart des cellules immunitaires.
Un anticorps qui reconnaît sa cible antigénique ne la lâche pas : leur étreinte est très forte.
On exploite cette propriété pour identifier les cellules immunitaires en demandant à nos ami·es chimistes de rajouter une petite molécule fluorescente sur l'anticorps, histoire de le voir de loin !
Voici les couleurs fréquemment utilisées : pas de doute l'immunologie est LGBTI+ 😂 🏳️‍🌈
Comme vous le voyez, ces couleurs ont un chiffre associé : une longueur d'onde en nanomètres.

L'idée est que l'on va éclairer *chaque* cellule avec plusieurs laser de couleur définie et regarder les anticorps fluorescents nous renvoient (fluorescence).
Un petit panels d'anticorps que j'utilise au quotidien... Il y en a pour à peu près 100 à 300 € HT/tube (0,5 ou 1 ml, on en utilise peu à chaque fois mais ça reste cher)
La recette : on met 100 à 200 000 cellules immunitaires de notre tumeur dans des tubes à essai, 0,001 ml de chaque anticorps fluorescent (il faut choisir les bons !), et on laisse 20-30 min au frigo. Ensuite, on lave bien et c'est prêt !
On laisse ensuite le soin à une grosse machine nommée cytomètre en flux de déguster nos délicieuses petites cellules immunitaires *nom nom nom* 😋

Voici une bécane très classique, utilisée au quotidien ⤵️
(Plusieurs centaines de milliers d'euros maintenance exclue)
Cette machine est un analyseur uniquement : elle n'est pas capable de garder les cellules en vie à la fin. Elles finissent toutes à la poubelle (bidons en bas à gauche de la photo)
Entre temps, les lasers et les tubes photomultiplicateurs font leur job et on obtient ce type de graphique.
Chaque point est une cellule et les échelles sont des intensités lumineuses.

Ici, des lymphocytes du sang sont divisés en lymphocytes B (CD19+) et lymphocytes T (CD5+).
Dans notre cas, on s'intéresse aux lymphocytes T grâce au marqueur CD8 qui distingue les lymphocytes T cytotoxiques (= qui sont capables de tuer directement des cellules tumorales par simple contact)
L'autre anticorps fluorescent n'est en réalité pas un anticorps mais une réplique synthétique du fameux "présentoir" des cellules présentatrices d'antigène !
Ce complexe majeur d'histocompatibilité et son antigène tumoral sont synthétisés en labo.
Cette grosse molécule est capable de se lier fortement au récepteur T (TCR) de nos lymphocytes T spécifiques de tumeurs.
Et là encore, on aura pris soin de lui adjoindre chimiquement une molécule fluorescente afin de la repérer.
Ce dextramère va donc nous pointer les cellules immunitaires spécifiques de la tumeur ! On peut les dénombrer et étudier par la méthode de cytométrie en flux leurs caractéristiques biologiques.
Si l'appareil de cytométrie en flux le permet, on peut même trier (et donc récupérer vivante) les cellules T positives. Ce qui permettra par exemple de cloner génétiquement leur récepteur T pr l'étudier voire créer des cellules T spécifiques de la tumeur de manière artificielle.
Je vous montre une image perso demain mais en voici une réelle :

À gauche un marquage d'antigène de tumeur (NY-ESO), à droite un contrôle négatif.
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