Thread by @OlgaVPettersson

Как спалось этим субботним утром, милые твиттеряне?
У нас дело идет к летним отпускам, на работе полный завал и я чуток умоталась.

Продираем глаза и наливаем себе кофе, т.к. сегодня у нас в программе КРИСПР!

1/X

2. На самом деле, называется все это дело CRISPR-Cas9, но начнем все по порядку.

Любая генная инженерия основывается на том, что ДНК нужно надрезать, чтобы вставить в молекулу нужный ученому кусочек. Как мы режем ДНК? В микроскоп же ее не видно? Ножницами и скальпелем же никак!

3. В клетках всего живого есть специальные белки-ножницы. Некоторые коцают ДНК наобум, где и как хотят. Другие же узнают только специальные сочетания букв. Зачем они нужны? В основном, чтобы изничтожить чужую ДНК.

4. Ну и всю ДНК которая в клетке находится в свободном плавании и не защищена гистончиками. Такой ДНК в клетке быть не положено.

Белки-ножницы народ открыл в самом начале 70х, и они очень хорошо исследованы (по-научному их зовут рестриктазами.

5. Используя базы данных, можно подобрать специальные белковые ножницы к нужной последовательности букв в ДНК. Такие белки можно заказать от биотех. компаний, которые их выделяют и очищают.

6. Однако, как вы понимаете, даже если ножницы узнают последовательность в 10 букв, а в геноме у человека букв-нуклеотидов 3,2 миллиарда, то возможно что резать ножницы будут во многих местах сразу. А что делать, если нужно отрезать только в одном специфическом месте?

7. Вот для этого и используется CRISPR-Cas9. Откуда он взялся?
Криспр - это часть природной системы иммунитета бактерий (да, у них таки тоже есть иммунитет, к вирусам).

8. Нашли его японцы в 80х, но поняли как он работает только в 2012 американка Дженифер Дудна, француженка Эмануэль Шарпентье и литовец Виргиниус Сикнис.

9. Если бактерию атакует вирус, и она от вируса излечивается, то сохраняет кусочки его ДНК у себя в особой картотеке, типа базы данных об особо опасных преступниках.
Эта картотека, вернее часть генома где она лежит, и называется CRISPR.

10. Когда схожий вирус снова пытается атаковать бактерию, отдел по борьбе с особо опасными врагами отечества сличает профиль преступника с картотекой и обезвреживает засранца.

Вся машина такого отдела клеточной полиции состоит из нескольких деталей.

11. На картинке внизу главный опер отдела, белок Cas9. Разноцветные шарики это атомы азота, водорода и кислорода, а торчат из них хвосты обрезаных ДНК-спиралей.

12. Опер Cas и занимается обезвреживанием бандита. Его можно научить искать любого преступника по особо важным приметам, что в нашем случае - длинная последовательность букв в ДНК вирусного преступника.

13. Помогает ему в этом обнаружении сыскари, они же миниатюрные молекулы РНК. Именно они переписывают из картотеки CRISPR особые приметы и точно наводят Cas на малину врага.

14. Сыскари присасываются к найденному врагу (на картинке gRNA), потом на место присасывания наваливается Cas и режет ДНК врага прямо в том месте, на которое указал сыскарь.

15. В 2017 первый раз этот процесс засняли в действии японские ученые.

https://twitter.com/hnisimasu/status/928933260159197184

Предвижу вопрос от моих постоянных читателей, поэтому сразу напишу что сделано это при помощи высокоскоростной атомно-силовой микроскопии (HS-AFM). Гуглите сами, мои золотые. 😉

16. Чтоб Cas не сошел с ума и пошел рубить собственную картотечную ДНК с той же последовательностью букв как и у врага, у клетки для этого припасен другой хитрый механизм, типа внедренного в банду агента (в его роли кусочек ДНК который зовут ПАМ).

17. Ежели Cas видит ПАМ, то малину можно брать. А если ПАМа нет, то значит что это не враг, а своя картотека.

Теперь, как можно бактериальный отдел по борьбе с вирусами заставить работать на клетки других организмов по указке ученых.

18. Оказалось, что в отдел к Cas можно направить массу новых сыскарей. Для этого ученые заказывают синтетические РНК-наводчики которые присасываются только к определенной последовательности в геноме - той, которая ученых интересует.

19. Т.е. даже если в клетке растения, или животного, нет своей картотеки, то к ним в клетку можно внедрить и Cas, и свежеобученного сыскаря и они пойдут искать свою цель и ее резать.

Как только Cas сделал надрез, то клетка возмущается и пытается все это дело склеить обратно.

20. Вариант первый. Клетка разозлится, так как никаких сигналов о возможном теракте она не получала, и попытается спаять разрезанные концы. Такое всегда делается быстро и тяп-ляп (процесс по-научному зовут "негомологи́чное воссоедине́ние концо́в” 🧐).

21. А тяп-ляп почти всегда будет с ошибками, т.е. новыми мутациями. В этом случае, ген становится с дефектом и выходит из строя, а значит теряет свою функцию и не будет из него никакого белка.

Вариант второй. На место разреза можно поставить заплатку нужного ученому вида.

22. Для этого заплатка, или короткий кусочек ДНК синтезируется отдельно и доставляется в клетку. Клетке легче подходящую заплатку поставить на место, чем с ошибками что-то там сшивать.

Таким образом, клетка получает новый ген взамен сломанного.

23. Теперича применение.

Помните, я уже писала что в случае разных генетических болезней имеем дефектный ген. Например, одна долбанная мутация в единственном гене CFTR может дать человеку цистический фиброз.

24. Больные этой дрянью обычно старше 20 лет не живут: идет серьезное поражение легких со всеми вытекающими. Поддерживают их жизнь тоннами лекарств, но в конце концов легкие отказывают и человек умирает.
Единственно возможное сейчас лечение это пересадка органов.

25. В ТЕОРИИ, если мы знаем что у эмбриона есть такая мутация, то можем подобрать систему CRISPR-Cas которая прикончит плохой ген и поставит на его место здоровый. Или, изъять половые клетки у родителя-носителя мутации и отредактировать их перед искусственным оплодотворением.

26. Это в теории. Основная проблема это то, что человеческий геном это безумно сложная штука и не смотря на декады изучения мы пока далеко не все знаем. Т.е. возможны побочки, о которых мы пока и догадаться не можем.

27. Вторая проблема это этика таких исследований. Работа с человеческими эмбрионами практически запрещена. На практике, можно получить очень трудоноступное разрешение на использование эмбрионов которые остались невостребованными после оплодотворения в пробирке у бесплодных пар.

28. Но тогда нужно предоставить 100пудовое доказательство максимально этичного к ним отношения.
Т.е. никаких крыльев, генов пауков-мутантов и прочей белиберды, а чисто исследования которые направлены на потенциальное спасение смертельно больных людей.

29. Много исследований делают на эмбрионах и яйцеклетках лягушек, мышей, крыс, итд. Но и для них необходимы этические разрешения.

Криспр-технологии еще моложе эпигенетики, и многое в технологии нужно доводить до ума.

30. Однако, в случае с растениями и микробами, Криспр широко применяют уже сейчас. Например, для создания тех же ГМО, когда ген нужной функции можно вставить с точечным прицелом именно на нужное место.

31. Ученые испытывают эту систему на комарах-переносчиках малярийного паразита. Комариха такая может дать потомство только самцам, а самцы кровь не пьют, и ген этот при спаривании самец может передать новой самке, которая произведет на свет только самцов, итд.

32. Таким образом, надеются снизить чисто заболевающих малярией в тропических странах.

Не знаю слышали ли вы, но производство шоколада в мире сейчас под угрозой, т.к. плантации какао-бобов сильно поражены грибковой болезнью.
(theguardian.com/lifeandstyle/2…)

33. Само собой, это сказывается на урожайности. Вместо того чтобы заливать какао химией чтобы ее потом есть, ученые пытаются криспрануть ГМО-какао с геном невосприимчивость к той заразе.

34. Криспр работает прекрасно, но, увы, не со 100% точностью, т.к. сыскари-РНК иногда отыскивают чуток отличающийся кусочек ДНК вместо искомого (т.н. “off-target effect”). Поэтому сейчас все клетки и организмы полученные этим методом проверяют на наличие неправильных встроек.

35. Но вернемся к людям и болезням.
Сам принцип применения Криспр-системы на мышах доказан для цистического фиброза, катаракты и некоторых типов анемии. Но чтобы на 100, и даже 99% убедиться что это абсолютно безопасно для людей, уйдет еще с декаду (как мне кажется).

36. Тут наука подошла к серой зоне этики. Потенциал немаленький, но в не тех руках это может обернуться в любую сторону. Хорошо, одно дело это лечение смертельных заболеваний. А если кому-то придет в башку использовать эту технологию для инженерии других признаков...

37. ... того же цвета глаз, например? Или атлетов-чемпионов? Или еще каких суперменов?

Вот сидят сейчас генетики, этики, законотворцы, итд сидят и ломают голову на тему что со всем этим делать, что можно а что ни в коем случае нельзя и какими законами все это надо регулировать.

38. Очень рекомендую посмотреть худ. фильм “GATACA”, научная фантастика именно на эту тему.

Для англоговорящих, так же советую посмотреть ролик .

39. Ну что, сладкие мои, проснулись?
Вот и мои мужики тоже проснулись и скоро принесут мне из пекарни свежие круассаны, а значит я отсюдова удаляюсь.

Как обычно, хороших вам всех выходных и спокойной недели. Не болейте!

@threadreaderapp unroll