Thread by @Dailymama_org

@crumble_mom Ok, ich fange bei Adam und Eva an 😁

Ich bekomme also einen Abstrich, da sind ein paar Zellen drauf und die kommen in eine inaktivierende Lösung, die Zellen und Virus platzen lässt und die RNA freilegt.

Die RNA reinige ich dann auf und dann gehen wir in die RT-qPCR.

@crumble_mom PCR macht man eigentlich mit DNA, normalerweise muss ich die RNA in einem Zwischenschritt umschreiben in cDNA. Das macht eine spezielle Polymerase.

Diese PCR-Kits machen das in einem Aufwasch. Zuerst wird aus der einsträngigen RNA doppelsträngige cDNA gemacht.

@crumble_mom cDNA steht übrigens für complimentary DNA.

Dann wird die Probe auf 95°C aufgeheizt um die reverse Transkriptase zu deaktivieren (also das Ding, dass die mich die cDNA gemacht hat) und die HotStart Polymerase zu aktivieren.
Außerdem trennen sich bei dieser Temperatur die Stränge

@crumble_mom Der cDNA.
Dann hab ich in dem Mix Primer (so nennen wir die kurzen einsträngigen DNA Stücke, die passgenau auf einen Abschnitt des Gens passen das uns interssiert) und Sonden, die fluoreszenz-gelabelt sind, und alle Bausteine die wir zum kopieren und abschreiben der Gensequenz

@crumble_mom Brauchen.

Wenn die DNA Stränge getrennt sind, senken wir die Temperatur, und die Primer und Probes können sich an die entsprechenden Genabschnitte setzen (so wie denn da sind - wenn nix da ist, passiert nix) und die Polymerase "schreibt ab" bis der Abschnitt fertig ist.

@crumble_mom Dann heizen wir wieder auf, die strange trennen sich, wir kühlen wieder runter (60°C), annealing, extension, wir heizen wieder auf, trennen, wir kühlen wieder ab,...

45x. Und zumindest in der Theorie findet immer eine Verdoppelung statt. Angenommen du startest mit einem

@crumble_mom Genabschnitte, dann gibt es nach dem trennen und abschreiben 2. Wenn die aufgeschmolzen und neu abgeschrieben werden gibt es 4. Dann 8, dann 16, dann 32,... Und immer wird das fluoreszenz-gelabelte Stück mit eingebaut und irgendwann haben wir so viel fluoreszenz, dass unser

@crumble_mom Detektor (vereinfacht gesagt wird nach jeder Runde ein Foto von der Probe gemacht), das Leuchten sehen kann. Und dann die Verdoppelung von dem Signal. Und die Runde darauf die Verdoppelung davon. Und so entstehen die Kurven auf dem Bild.

@crumble_mom Wenn wir also mit ganz wenig Ausgangsmaterial haben, dauert es viele Zyklen, bis wir ein Signal haben. Je mehr Ausgangsmaterial, desto schneller haben wir eine (für den Detektor) sichtbare Fluoreszenz.

@crumble_mom Das was bei uns, in dem gezeigten Assay passiert, sind 3 verschiedene Gene, die gemeinsam in einer Probe nachgewiesen werden können. Die Gene sind mit unterschiedlichen Farben gelabelt. Das blaue ist FAM, damit ist das N-Gen (Virus) gelabelt. Das rote ist ROX, mit dem RdRp

@crumble_mom (Virus) gelabelt ist, und das grüne ist RNase P, ein humanes Gen, mit dem wir überprüfen ob überhaupt Zellen auf dem Abstrich drauf waren. Wir können uns falsch negativ nämlich nicht leisten!

@crumble_mom Achso, der "grüne" Farbstoff heißt HEX.
Der Vollständigkeit halber 😁

Hat jemand noch andere Fragen? 😊