Thread by @OlgaVPettersson

У нас субБота, милые твиттеряне. Как вы там, держитесь?

Казак обещал генетические тесты? Казак сделал.
Не спится, проснулась в 5 утра. Пока семья дрыхнет, таки напишу. 1/Х

0. Сегодняшние дикслеймеры:
А. Moe орудие труда это содержимое черепной коробки. А оно подустало за последние пару дней. Не обещаю ответов на все вопросы, заранее прошу “отнестись к этому с пониманием” т.к. “этот год был нелегким”, а нам на работе действительно “нужен прорыв”.

0.Б. Б. Если в напряг читать мои треды короткими сообщениями:
- подпишитесь на аккаунт Thread Reader App
- в моем треде пишете то что на картинке внизу
- получаете ссылку на слитный текст.

1. Поехали.

1. Генетические тесты нужны чтобы определить мутации (изменения) в хромосомах или генах.
Видов масса, пойдем от простого с сложному.

2. I. Тест на коротенький кусочек гена или последовательности между генами. Это делается в основном методом ПЦР. Как писала раньше, принцип ПЦР такой: в одну пробирку сливаем ДНК пациента, полимеразу, еду для полимеразы и затравку (праймер).

3. Праймер, это синтетический кусочек ДНА в 12-30 букв А, Г, Т, Ц (в основном, но бывают и вариации). Его последовательность букв это магнит, который присоединится к куску ДНК с тождественной последовательностью.

4. Т.е. он выуживает тот кусок ДНК, который нам интересен. Потом в дело идет полимераза, а как вы помните из предыдущих тредов, она копипастит тот нужный кусок ДНК, к которому присоединился праймер.

5. Путем смены температурного режима реакции, мы можем регулировать длину куска, который нам нужно размножить (от 100 букв до 13 тысяч). Размножение нужного куска, это выделение его крупным шрифтом, чтобы его можно было детектировать.

6. После ПЦР, содержимое пробирки разделяют гель-электрофорезом (смотрите

https://twitter.com/OlgaVPettersson/status/1229027500468076548

). Если видим жирную полосу, то ПЦР позитивна. Если нет - негативна. См. фото ниже (на фото слева маркер, помогающий определить длину откопипащенного куска ДНК).

7. Пример использования ПЦР на 1 ген - определение патогенов, диагностика болезней вызываемых только одним геном (мышечная дистрофия Дюшенна, некоторые типы рака, итд).

ПЦР дает нам грубый ответ, ДА или НЕТ, когда у нас есть четкий вопрос. Чувствительность высокая.

8. II. Генотипирование, или молекулярный отпечаток пальцев, методом ПЦР.
Это разновидность ПЦР, где используется сразу несколько затравок. Когда делаем электрофорез, то уже видим не одну полоску, а вот такую картину (справа и слева контроль длины молекул) >

9. Типичнейшие примеры, это тест на отцовство или криминологические тесты. Есть у нас в геноме т.н. STR маркеры. Это коротенькие кусочки ДНК, где одни и те же буквы повторяются несколько раз подряд, например ГТЦ ГТЦ ГТЦ ГТЦ.

10. Они рассредоточены по всему геному, и ничего особого там не делают, просто есть. Их количество и длина поворотов индивидуальна для каждого человека, это можно сравнить с отпечатком пальцев.

11. Как делают > берут ДНК у мамы, папы и ребенка, делают одну ПЦР на человека, и делают форез. У мамы будет одна картина, у папы другая, а у ребенка будет смесь.

12. Вот иллюстрация позитивного теста, где первая полоса мама, вторая ребенок, третья папа.
Как видите, у ребенка смесь и лиловых (мама), и красных (папа).

13. А вот если родители не уверены, то можно добавить еще одного подозреваемого отца (крайний справа). Тут видите сами, совпадений гораздо меньше.

14. Типичный пример криминологического теста.
Слева направо > сцена преступления, жертва, подозреваемый 1, подозреваемый 2. Посадят первого.

15. A тут пример генетического теста на одну болезнь, два слева это здоровые люди, три справа - пациенты.

16. Такие тесты достаточно точны, но иногда могут дать недостаточно чувствительный результат. Им можно верить процентов на 98, но всегда есть погрешность.

17.
II. Генотипирование методом микрочипа (SNP array).
В основе генетические отличия в результате точечных мутаций (Single Nucleotide Polymorphism, SNP). Типичнейший пример, это тесты которые делает 23andMe и Ancestry.

18. Сейчас в мире расшифрована пара миллионов индивидуальных человеческих геномов. Ученые нашли точечные мутации, которые коррелируют с разными признаками. Например, у людей с общими предками, или у людей с определенным цветом волос, или у людей с определенным типом рака, итд.

19. Тут на стеклянный чип робот наносит маленькие кусочки контрольной ДНК, в котором есть такие мутации. Такие чипы продаются коммерчески, на них можно нанести от пары сотен, до сотен тысяч таких контрольных кусочков. Они окрашены зеленой флуоресцентный краской.

20. Потом на такой чип наносят ДНК трестируемого человека. Ее красят красным флуорофором.
ДНК теста, и ДНК на чипе, взаимодействуют между собой.

21. Если у пациента есть нужная мутация, то красный сольется с зеленым, и даст оранжево-красный. Это позитивный результат. Если останется зеленым, то мутации нет.

22. Это дело считывает микроскоп, т. к весь чип с тысячами мутаций умещается на ладони (и еще место останется), результат обрабатывается компьютером.

Чувствительность высокая, но и погрешность не маленькая. Не видно новых мутаций, которых небыло в контроле.

23.
IV. Секвенирование участков генов (exome sequencing).
В каждом гене в ДНК есть участки которые кодируют части белка, а есть и участки, грубо говоря, пустые. Раньше считалось что они просто мусор, на них внимания обращали мало.

24. Но, как выяснилось позже, они очень важны для регуляции различных функций.
Но все едино, очень много информации можно получить из кодирующих белки участков (т.н. экзонов). Например, в человеческом геноме всего 2% кодирующей белки последовательности букв.

25. Если их выловить из 3,2 миллионов букв, то останется где-то 300 000.

С этим массивом данных легче и дешевле работать. Экзоны вылавливают из образца ДНК либо ПЦР, либо специальными наживками, а потом секвенируют на аппаратах с большой мощностью.

26. Тут уже методом Сангера не обойдешься, тут работают аппараты фирмы Иллюмина. Они считывают до 600 триллионов кусочков зараз. Машина Сангера, если помните, расшифровывала максимум 384. Прогресс, однако.

27. Секвенирование экзомa мы очень широко используем в клинике. Для обработки данных привлекаются мощные компьютеры, связанные с мировыми базами данных. В таких базах есть информация о частоте встречаемости мутации, ее роли в болезни, итд.

28. На основании этого типа теста врачи могут поставить диагноз, подобрать лекарственный препарат. В онкологии это дает узнать почему больной быстро развил метастазы, как на него подействует химиотерапия, каких неожиданностей ждать от болезни итд.

29. Этот метод рутинно используют мои коллеги в Стокгольме для постановки диагноза младенцам, которые очень плохо себя чувствуют с самого рождения. Ответ можно получить уже за сутки, так как там счет идет действительно на часы.

30. Помимо того, этот тест можно использовать при искусственном оплодотворении, если у родителей есть наследственные заболевания. На самых первичных стадиях после оплодотворения, можно взять буквально одну или пару клеток, сделать такой, чтобы узнать будет ли ребенок здоров.

31. Такие тесты никогда не делаются из праздного любопытства. Тут идет речь о смертельно опасных генетических болезнях - цистический фиброз, болезнь Хантингтона, метаболические заболевания, итд.

32.
V. Расшифровка всего генома.
Это самая тяжелая артиллерия. Самая дорогая, самая трудно анализируемая. Ее используют когда ни один из предыдущих тестов не дал ответ.

33. Очень часто используется в онкологии, редких заболеваниях неизвестного происхождения, итд. Плюс - огромное количество информации. Минус - понять что именно вызывает болезнь.

34. Здесь огромную роль играет программирование, использование искусственного интеллекта, математическое моделирование, итд.

35. Ок, ребята. Семья просыпается.
В следующие выходные, если жива буду, напишу о толковании генетических тестов. Можно ли предсказать как вам тренироваться, что есть, в какую секцию отдать ребенка, проследить генеалогию, итд.

36. Если ситуация прояснится, то потом напишу о различных видах тестов на коронавирус.

Будьте здоровы и берегите себя!!!

37.
Вдогонку 1.
Чем занималась моя черепная коробка. Не тем, как спасти мир.
Мы должны поддержать больницы поголовным тестированием. Параллельно, сделать анализы так, чтобы их в последствии можно было использовать для научных изысканий.

Сейчас идет координирование на уровне большой инфраструктуры. Нужно списаться с коллегами, чтоб не делать одну работу дважды, покрыть весь фронт работ, составить сметы, заказать реагенты, итд. До спасения мира очень далеко, мы этим заниматься не будем. Мы научная передовая.