Thread by @OlgaVPettersson

Одна из последних суббот года, милые твиттеряне, a значит всем привет от рептилоидов!
Сегодня продолжим борьбу с мракобесием и разберем миф о том, что коронавирус никем не выделен и никто его в глаза не видел.

Кофе налили? Удобно сели? Тогда мы начинаем.

Я всегда говорила, что пишу о том, в чем разбираюсь. В свое время я работала с человеческими патогенными бактериями, а у тех бактерий были свои вирусы. Я своими двумя руками эти вирусы выделяла, рассматривала, и работала с их генетическим материалом.

Т.е., умею и выделять, и в электронный микроскоп рассматривать. Чтобы не быть голословной, туточки есть тому пруф с картинками journals.plos.org/plosgenetics/a…

Вернемся к нашим баранам. Как выращивают коронавирус? Вирусы можно растить по-разному, в куриных яйцах, например. Но коронавирусам подходят только клеточные культуры.

Наиболее часто это клетки VERO (линия первоначально была выращена из почек африканских зеленых мартышек, и с тех пор выращивается на питательных средах в коммерческих масштабах). Кроме них, часто используются коммерческие человеческие клеточные линии.

Итак, медработник ватной палочкой собирает образец со слизистой носоглотки у больного человека. Ватный тампончик отрезается и кладется в буферный раствор, в который переходят вирусные частицы.

Буферный раствор переносят в плоскую фляжку с клетками, которые растут в питательной среде. Самочувствие такой клеточной культуры можно оценить, наблюдая её под микроскопом. Например, имеет ли место массовая гибель клеток (что типично при вирусной инфекции).

Количество копий вируса в клетках можно оценить методом квантитативной ПЦР (простую ПЦР я описала тут

https://twitter.com/OlgaVPettersson/status/1243789737456013312

, а квантитативную проводят на немного других машинах, добавляя флюоресцирующие пробы и она более чувствительна чем простая ПЦР).

После того как вирус размножился в клетках, наступает пора его оттуда выделить.
Для вирусов есть масса протоколов выделения, в зависимости от их образа жизни. Вирус ковида спокойно выделяется из жидкости, в которой растут клетки.

Для начала, еще живые клетки и ошметки клеток умерших необходимо отфильтровать, чтобы оставить только жидкость, содержащую частички вируса.

На картинке видны такие фильтры, размер их пор составляет до долей микрона.

Через фильтр пройдет раствор в котором могут находиться только вирусные частицы.
Вирусы размерами бывают разные, но и фильтры тоже имеют свою линейку размера пор.

Теперь, вирус нужно концентрировать, чтобы не искать крохотные частички в большом объеме.
Можно использовать ультрацентрифуги, или можно к фильтрату добавить полиэтиленгликоль.

Вещество это имеет массу областей применения, от составляющей ракетного топлива, до составляющей лекарств от запора; оно не токсично. В данном случае, это вещество осаждает частички вируса на дно пробирки.

После того, пробирку центрифугируют и собирают со дна осадок.

Статей с использованием этого метода для выделения вируса вызывающего ковид достаточно, надо только иметь желание поискать. Например,
ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P…
ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P…

Теперь, вирус у нас выделен в чистом виде, а с чистым вирусом можно делать любое биомедицинское исследование.

CDC, например, предоставляет чистые культуры вируса, размноженные на клеточных культурах, для исследований вакцин и прочая cdc.gov/coronavirus/20…

Это к вопросу о том, что вирус “никто никогда не выделял”.

Отдельным тезисом сторонников теории “никто никогда не выделял” является тезис, что вирус можно выделить центрифугированием крови пациента.

Из прогнанных через мясорубку легких пациента - можно, а из крови нет - в крови присутствует вирусная РНК, а не сами частицы.

Kак расшифровывают геном этой дряни?

Итак, имеем чистый вирус на дне пробирки. Чист он относительно, т.к. через фильтр могли пробраться человеческие или мартышкины белки и РНК из клеточной культуры.

Вирус у нас упакован в капсид, он же белковая оболочка.

Поэтому, фильтрат с вирусными частичками обрабатывают ферментами, которые разрушают любую чужеродную ДНК и РНК. Белковая оболочка защитит генетический материал вируса от этих ферментов, и в конце концов в растворе будут плавать только чистые вирусные частички.

Без ошметков людей и мартышек. Это крайне важно, чтобы быть уверенным в том, что работа ведется только с генетическим материалом вируса.

Теперь, к раствору с частичками добавляют фермент, который разрушает только белки, т.е. растворяют вирусную оболочку.

Таким образом, РНК вируса переходит в раствор. Ее отделяют от белка (масса разных методик, чище всего это делать с фенолом и хлороформом). На молекулы РНК навешивают адаптеры - короткие последовательности нуклеотидов, которые распознает машина-секвенатор.

Такой образец называют “геномной библиотекой”. Библиотеку прогоняют через секвенатор и он расшифровывает генетический код.

После этого, файлы с кодом (буквы А, Г, Т, Ц в разных последовательностях) обрабатывает компьютер и собирает их как пазл.

Это применимо ко ВСЕМ геномам, не только вирусным. Раньше все это делалось вручную, но это долго и муторно, а результат будет такой же.

Чтобы убедиться что ни дай бог в анализ не затесалась ДНК человека или обезьяны, ...

...все полученные данные сравниваются с базами данных с расшифровками человеческих и обезьянник генов. В таких базах миллионы образцов, так что есть с чем сравнивать.

Первые геномы января 2020 делались в спешке.

В них есть считки генома человека.

Как мы знаем, что вирус не встраивается в геном? Чтобы быть уверенным в этом, необходимо смотреть на сами считки.

Если б он встраивался, то в одной считке были бы молекулы, где часть человеческая, а часть вирусная.

А если в образце была примесь человеческого генома, то считки человеческие не будут содержать последовательности вируса, а вирусные - человеческие.

То и наблюдаем.

Все, геном собран. Его сравнивают с огромными базами данных других вирусов и делают разные генетические анализы.

Такие геномы чистые, безо всяких промежутков, и ничего никакие нейросети никуда не добавляют и ничего не заполняют.

Даже если вирус не изолирован в чистые культуры, его можно секвенировать и из клинических образцов после забора у пациентов.

В таком случае, начинаем с уже известного всем ватного тампончика. Его помещают в особый буфер, который растворяет все белки и ДНК пациента.

В остатке получается только РНК, как вируса, так и человека.

Всю РНК переводят в ДНК для секвенирования при помощи особого фермента, обратной транскриптазы.

На основании качественных геномов, которые были получены из чистых культур (например ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P…, ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P…, tandfonline.com/doi/full/10.10… journals.asm.org/doi/10.1128/jv…, и т.д.), на полученную ДНК делается специальная ПЦР.

Она вылавливает только генетический материал вируса, и не обращает внимание на генетический материал пациента. Эта ПЦР вылавливает не отдельные кусочки вируса (тот же ген шипа), а ВЕСЬ геном полностью.

Наша лаборатория использует в основном протоколы ARTIC artic.network/ncov-2019 и AmpliSeq thermofisher.com/se/en/home/lif….

Продукты ПЦР секвенируют на машинах большой мощности.

Таким образом, на данный момент имеем около несколько миллионов геномов вируса которые расшифровывают в сотнях лабораторий по всему миру.

На основании их, можем уже исследовать распространение вируса, моделировать вакцины, отслеживать разные штаммы и прочая.

Для сторонников конспирологии, приведу т.н. филогенетическое дерево, или анализ родства между различными штаммами, что создано на основании полногеномных расшифровок nextstrain.org/ncov/gisaid/gl… (там и наши Шведские геномы имеются в достатке).

Продвинутым будет особенно интересен и метод: pnas.org/content/117/17….

Кроме того, из чистой культуры можно выделить и вирусные белки. При помощи магнитного резонанса и кристаллографии можно их и определить, узнать их свойства и смоделировать их структуру.

А вместе с генетическим кодом, можно разобрать по кирпичикам из каких аминокислот состоят эти белки, как они кодируются вирусом, какие функции имеют, и так далее.

Это к тому, что ”никто не знает, что это за вирус”.

И третье, что вирус ”никто никогда не видел и электронным микроскопам нельзя верить”, потому что ”он показывает только тени”. Вероятно люди, которые распространяют эту информацию, не просвещены о последних разработках в электронной микроскопии.

Те красивые фото вируса, что видим в сети (flickr.com/photos/niaid/a…) получены при помощи метода E-SEM, сканирующей электронной микроскопии (Scanning Electron Microscopy). Они художественно покрашены, т.к. микроскоп цвета не видит, но все структуры показаны верно.

E перед SEM значит environment, или среда. Раньше, чтобы рассмотреть образцы под электронным микроскопом их высушивали и покрывали слоем платины или золота, в результате чего структуры клеток часто деформировались.

E-SEM позволяет наблюдать биологические образцы без высушивания и напыления металлом, что само по себе революционизировало всю область клеточной биологии. Кому интересно забуриться в технологию, есть статья в Википедии en.wikipedia.org/wiki/Environme… и тонны видео на Ютюбе.

Коротко, как работает метод: клеточную культуру растят в один слой прямо на предметном стекле или специальной подложке, которая пойдет под микроскоп. Эту культуру заражают вирусом.

Микроскоп меняет фокус и рассматривает образец на различной глубине, делая фотографию после сканирования каждого слоя. Фотографии накладываются друг на друга, и как 3Д пазл складывают вид клеточного ландшафта.

Последние электронные микроскопы настолько хороши, что могут рассмотреть даже белковые структуры (о которых исследователи около 10 назад люди могли думать только гипотетически).

Как узнать, что на фотографии именно вирус вызывающий ковид?

Образец можно покрасить при помощи антител.
Синтезируются специфические антитела к определенным белкам вирусной оболочки, и каждое антитело несет на себе флуоресцирующий краситель.
Когда такие антитела соединяются с оболочкой, краситель-флуорофор активируется и начинает светить

При помощи другого, уже флуоресцентного микроскопа, можно рассмотреть какие именно участки клеток светятся, и какие структуры находятся в светящихся участках.

Поскольку красители соединены с антителами, специфичными для вируса, то можно достоверно увидеть, ...

... есть ли в образце вирус, и в какой части клетки он находится.
Можно с помощью специфических антител подкрасить различные белки вируса разными флуорофорами, и увидеть, как именно они сидят вместе в оболочке.

flickr.com/photos/niaid/a… показывает фото вируса, где его цвет отличается от других клеточных структур. Цвет в данном случае - ни что иное, как художественная интерпретация (колоризирование), но сочетание E-SEM с флюоресцентной фотографией позволяет ясно различить, где сам вирус...

... а где различные клеточные структуры. Почему? Потому что у каждого флюорофора свой спектр.

Национальный Институт Аллергологии и Инфекционных заболеваний, который выпустил эти фотографии, уже много лет применяет эти методы для исследования и других вирусов, ...

... например MERS (flickr.com/photos/niaid/).

Это к тому, что вирус ”никто не видел”.

Отсебятина: у меня создалось ощущение, что люди, которые лепят подобные заявления, имеют представление о том, какой была наука лет 20 назад, но абсолютно не интересуются развитием технологий.

Особенно печально, когда подобные заявления делают обладатели докторских и медицинских степеней, т.к. у их слов есть вес, подпитанный регалиями.

Я сделала выкладку научных доказательств с описанием методик и источников, а выводы все делают сами.

Комментарии по поводу твитов с “альтернативными мнениями” давать не буду, в препирания вступать тоже.

Большое спасибо коллеге Тигре @TiggerBurning за первое прочтение треда и поддержку.

Постскриптум: мне часто пишут в личку и просят прокомментировать различные заявления, статьи и прочая. Я отвечаю по мере сил, но у меня иногда не хватает ни времени, ни здоровья.

Очень часто, чтобы разобраться в вопросе, необходим первоисточник, например научная публикация, на основании которой было сделано заявление.

Ну и насущное, будут ли треды каждую субботу, как раньше?

Я честно не знаю. Буду писать по мере возможности, но в этом году у меня на работе больше обязанностей, чем раньше, а свободного времени все меньше.
Что будет в следующем - предугадать сложно.

А пока - всем хороших выходных, и берегите себя!

@threadreaderapp unroll