Thread by @ligero999

Comenzamos con el cuarto hilo de #COVIDJournalClub, en el que @micromunidad, @MariadelMarTom y yo os contaremos el diagnóstico microbiológico del #SARSCoV2. Así pues, empezamos.

El diagnóstico microbiológico es fundamental para:
1) poder identificar y aislar a las personas infectadas, evitando la propagación del virus.
2) rastrear y seguir los contactos estrechos de casos confirmados con la infección.

3) proporcionar conocimiento acerca de las tasas de seroprevalencia regionales y nacionales y grupos de riesgo.
4) ver la evolución de la infección por COVID-19.
Antes de empezar, hagamos un repaso de las distintas partes del virus, así se entenderá posteriormente mejor.

#SARSCoV2 es un virus RNA monocatenario, positivo, con envoltura y con una nucleocápside de simetría helicoidal perteneciente a los betacoronavirus.
El genoma codifica para 5 proteínas estructurales: la S (glicoproteína estructural)...

…responsable de la unión del virus a su receptor: la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE-2), la M (de membrana), la N (nucleocápside), la E (envoltura) y la HE (hemaglutinina-esterasa) que se encuentra solo en los betacoronavirus.
science.sciencemag.org/content/367/64…

Hay dos formas de detectar que has estado en contacto con el virus: una forma directa y una indirecta.
En la forma directa detectas una parte del virus que puede ser:
1) el genoma (mediante la RT-qPCR)
2) sus proteínas o antígenos (mediante test rápido antigénico).

En la forma indirecta detectas los anticuerpos generados frente al virus.
Bien, empecemos hablando de la RT-qPCR (cuyas siglas en inglés significan Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction).

Es una técnica molecular de amplificación y cuantificación simultánea de ácidos nucleicos, es decir de material genético, ARN, del SARS-CoV-2 en distintas muestras biológicas clínicas. En la actualidad es la técnica de referencia y de elección para el diagnóstico de COVID-19.

Esta PCR que es a tiempo real nos ofrece ventajas sobre la PCR convencional que quedan resumidas en el siguiente cuadro. Que me perdonen los biólogos moleculares si me dejo cosas…

El proceso hasta que se realiza la PCR, sigue varios pasos que incluye:
1) la toma de muestra: es fundamental realizarla de manera adecuada para evitar falsos negativos de la PCR.

Se pueden tomar del tracto respiratorio superior en el que englobaríamos el exudado nasofaríngeo y el orofaríngeo o del tracto respiratorio inferior en el que englobaríamos el esputo, las aspiraciones traqueales y el lavado broncoalveolar (BAL).

La sensibilidad de la PCR variará en función de dónde se tome la muestra, siendo + sensible si se realiza en el tracto respiratorio inferior. En un estudio, fue de un 93% en BAL, un 72% en esputos, un 63% en ex. nasofaríngeos y un 32% en ex. orofaríngeos.
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3215977…

El exudado nasofaríngeo es el más aceptado, y tiene una técnica correcta de extracción que se puede ver en este video:

Recientemente, ha sido publicado un trabajo donde se analiza la sensibilidad de tomar la saliva como muestra en la RT-PCR para la detección de ARN de SARS-CoV-2, presentando un índice Kappa de concordancia con la muestra nasofaríngea de 0.851.
pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32422408/

2) La PCR en sí que incluye dos partes:
2.1) la extracción de los ácidos nucleicos: el procedimiento general consiste en 3 etapas consecutivas: disgregación de las células (lisis celular), inactivación de las nucleasas intracelulares y separación de los ácidos nucleicos.

2.2) la amplificación de los ácidos nucleicos: para ello necesitaremos una enzima, la transcriptasa inversa, que sintetizará DNA a partir del RNA del virus. A partir de ahí, se producirán millones de copias de un fragmento determinado de ese DNA...

… detectándose en cada ciclo de amplificación gracias a un sistema de detección incorporado que pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas específicas marcadas con fluorocromos.

Los termocicladores incorporan lectores de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida.
Os dejo este artículo ya antiguo, pero que explica muy bien la PCR a tiempo real:
elsevier.es/es-revista-enf…

Las dianas a las que pueden estar dirigidas son las siguientes: gen N, gen E, gen S, gen ORF1ab o el gen RdRp. Para hacernos una idea de donde quedan localizadas os dejo la siguiente imagen. También os dejo otra imagen donde se puede ver como quedaría la gráfica de la PCR.

Os dejo también un artículo en el que comparan 7 kits comerciales de RT-PCR para el diagnóstico del virus:
sciencedirect.com/science/articl…

Consideraciones sobre la PCR:
1)la detección de RNA viral va ser máxima desde 1 o 2 días antes de empezar los síntomas hasta pasado 1 semana del comienzo de los síntomas. Ese es el mejor momento para realizar la PCR.

A partir de la 2ª semana comienza a disminuir la carga viral y la sensibilidad de la PCR hasta ser casi indetectable en la cuarta semana.
2) Puede haber falsos negativos. Estos se pueden deber bien a una toma de muestra deficiente...

...a una toma de muestra en un momento inadecuado de la infección, liberación del virus intermitente, a una carga viral baja o a fallo en los reactivos o inhibición de la reacción.

Una revisión sistemática que se hizo mostró unas tasas de falsos negativos que oscilaban entre un 2 y un 29%.
medrxiv.org/content/10.110…

3) Una sola PCR (-) no debe considerarse como definitiva si el paciente tiene síntomas sugestivos de COVID-19. Debe repetirse a los 2 o 3 días.

4) También es importante destacar, que se han descrito casos de positividad de la RT-PCR hasta 28 días desde la resolución de los síntomas sin confirmarse la presencia del virus infeccioso y en presencia de seroconversión, lo que proporcionaría inmunidad a la reinfección.

El estudio en sí, es este:
medrxiv.org/content/10.110…

Pasemos a hablar ahora de la detección del virus a través de la detección de sus proteínas o antígenos. En eso se basan los test rápidos de detección de antígenos.
En un soporte se añaden anticuerpos específicos que reaccionarán específicamente contra una proteína del virus.

Tras tomar la muestra (muestra respiratoria igual que para la PCR), se inocula un poco en el test y si hay partículas virales, estos anticuerpos se pegarán al antígeno. Al mismo tiempo, hay un segundo anticuerpo marcado que se unirá al virus y que pondrá de manifiesto la unión.

En esto se iban a basar los primeros test que compró el gobierno a la empresa China Bioeasy y que fueron un fiasco. Los ensayos preliminares que se hicieron marcaron una sensibilidad de un 30%, altamente ineficaz para la incorporación en la rutina de diagnóstico del virus.

Posteriormente, se compraron otros test rápidos de la misma compañía y que demostraron también que la sensibilidad era mucho menor a la prometida. Aquí os dejo un enlace a la noticia:
elpais.com/sociedad/2020-…

Se ha determinado que la mediana de seroconversión para los anticuerpos (Atc) IgM es de aprox. 12 días y para las IgG de 14. La detección de Atc en la 1ª semana es de menos de un 40%, aumentando hasta casi un 100% a partir de la 2ª semana.
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32221519

Es interesante por lo tanto remarcar, que los métodos diagnósticos de anticuerpos se realicen cuando haya pasado un mínimo de 8-9 días de sintomatología para evitar falsos negativos de la técnica.

Actualmente, se están utilizando 2 técnicas distintas para el diagnóstico: los test rápidos inmunocromatográficos cuya sensibilidad es muy variable entre los distintos kits, (desde un 70% hasta un 85%) y los automatizados cuantitativos (ELISA y CLIA) cuya sensibilidad...

… es mucho mayor (cerca de un 98%)
medrxiv.org/content/10.110…

A continuación @micromunidad nos hablará un poco más detalladamente de los test de detección de anticuerpos entre otras cosas.

Las técnicas inmunocromatográficas (inmunoensayos de flujo lateral), sirven para detectar anticuerpos (IgM, IgG o totales) en un corto periodo de tiempo (15-20´), con muestra de plasma, suero o sangre capilar

La aparición de bandas se basa en la inmovilización de anticuerpos conjugados con partículas (de oro en este caso) tras la migración de la muestra a través de tiras de nitrocelulosa.

Al pasar por los anticuerpos inmovilizados (anti IgM/IgG humanos) y fijarse, forman la banda visible (IgM, IgG).
Estas técnicas han generado polémica sobre su utilidad y características, por lo que distintas sociedades y organizaciones han publicado recomendaciones.

Entre otras la de la SEIMC:
seimc.org/contenidos/doc…
Y la de la OMS:
who.int/news-room/comm…

De hecho, el primer dato que ha salido del estudio de seroprevalencia español se basa en los datos obtenidos a través de estas técnicas, complementados con los de quimioluminiscencia.

Aquí os dejo el estudio:
mscbs.gob.es/ciudadanos/ene…
En este estudio, se utilizó el kit de inmunocromatografía Orient Gene IgM/IgG, que tiene, (según el fabricante) una sensibilidad del 88% y 97% para determinar IgM e IgG respectivamente, y una especificidad de 100%.

En estudios de fiabilidad realizados para ENE-Covid19 se comunicó una sensibilidad del 73% y del 79% respectivamente para IgM o IgG, y una sensibilidad del 85% considerando positividad en cualquiera de los isotipos, con una especificidad del 98% para IgM y del 100% para IgG.

La especificidad y la sensibilidad para la detección de IgG de la prueba rápida evaluada aquí está muy en línea con las de un ensayo tipo ELISA recientemente informado, que tenía una especificidad y sensibilidad del 97,5%.
medrxiv.org/content/10.110…

En otro estudio se analizó dicha técnica en comparación con los resultados de PCR positiva, y 124 controles negativos. Los resultados revelaron una sensibilidad del 93.1% para IgG, basadas únicamente en la positividad de PCR debido a la ausencia de un estándar de oro serológico.

Se demostró que las especificidades del ensayo eran del 99,2% para IgG.
confirmbiosciences.com/wp-content/upl…

Las técnicas cuantitativas se basan en técnicas de ELISA y quimioluminiscencia (CLIA). En la 1ª, el producto (Ag o Ac) inmovilizado se detecta mediante la adición de la muestra y 1 conjugado asociado a 1 reacc. colorimétrica, en la 2ª se trata de 1 reacc. quimioluminiscente.

Resulta importante la cuantificación de estos anticuerpos a la hora de valorar la duración en el tiempo de los mismos, y a la hora de poder establecer un dintel que se relacione con la protección frente al virus.

En este artículo se evidencia la distinta cinética y correlación con los anticuerpos neutralizantes en función de las dianas.
wwwnc.cdc.gov/eid/article/26…

Los anticuerpos generados y medidos son distintos en función del ensayo, existiendo ensayos frente a N, E, S1, S2 y dominios del receptor… Los resultados obtenidos en los distintos artículos varían ligeramente dependiendo de las dianas elegidas.

Los ensayos de neutralización nos hablan de cómo los Ac. neutralizan directamente al virus, y por lo tanto se correlacionan con la inmunidad. En este pre-print se correlacionan serologías de 175 pac. con distintas dianas y con anticuerpos neutralizantes.
medrxiv.org/content/10.110…

Finalmente, destacar este paper publicado en la revista Science sobre la utilizada de las pruebas serológicas para estudios de seroprevalencia en grupos de riesgo como sanitarios, así como detección de donantes de suero hiperinmune y desarrollo de vacunas.
science.sciencemag.org/content/early/…

En cuanto a la bioseguridad con las muestras biológicas en el lab: diversos organismos han realizado sus recomendaciones. Como norma general, hace falta 1 cabina de bioseguridad tipo 2 (salvo para cultivo que hace falta BSL-3).
-cdc.gov/coronavirus/20…
-apps.who.int/iris/bitstream…

Por último, @MariadelMarTom nos hablará de las técnicas o estrategias diagnosticas innovadoras para el diagnóstico de COVID19.

Evaluación de la prueba COVID-19 RT-qPCR en grupos de muestras múltiples: se puede detectar una sola muestra positiva en grupos de hasta 32 muestras, utilizando los kits y protocolos estándar, con una tasa de falsos negativos estimada del 10%.
academic.oup.com/cid/advance-ar…

La prueba de grupo mediante RT-PCR COVID-19 permitiría expandir las capacidades de detección actuales, permitiendo así la expansión de la detección en la comunidad, así como en grupos orgánicos cercanos, como departamentos de hospitales, unidades del ejército o turnos de fábrica.

Se desarrollaron ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) para detectar ARN genómico de SARS-CoV-2.
Los ensayos de RT-LAMP informados en este estudio pueden detectar tan solo 100 copias de ARN del SARS-CoV-2.

No se observó reactividad cruzada de los ensayos de RT-LAMP a otros coronavirus humanos. Se adaptó un método de detección colorimétrico para este ensayo RT-LAMP para permitir un mayor rendimiento.
jmd.amjpathol.org/article/S1525-…

Resultados preliminares aportados por otros autores que desarrollaron un ensayo LAMP de transcriptasa inversa de un solo paso (RT-LAMP), que puede detectar hasta 500 copias virales en 30 minutos en 47 casos confirmados y 213 pacientes negativos demostraron…

… un alto grado de especificidad (99.5%), sensibilidad (91.4%), valor predictivo positivo (97,7%) y valor predictivo negativo (98,1%) cuando se usa en relación con qRT-PCR.
medrxiv.org/content/10.110…

Otro trabajo publicado recientemente en CMI, llevan a cabo un ensayo de amplificación isotérmica asistida por recombinasa de transcripción inversa (RT-RAA) para SARS-CoV-2 utilizando 926 muestras clínicas de múltiples centros.

clinicalmicrobiologyandinfection.com/article/S1198-…

La sensibilidad y especificidad de RT-RAA fue 97.63% y 97.87% respectivamente. El valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) fueron 96,21% y 98,68% respectivamente. La tasa de coincidencia total fue del 97.78% y la Kappa fue de 0.952 (P <0.05).

Método de ensayo todo en uno Dual CRISPR-Cas12a (denominado "AIOD-CRISPR") para la detección simple, rápida, ultrasensible, de un solo recipiente y visual del coronavirus SARS-CoV-2 y el virus del VIH.
biorxiv.org/content/biorxi…

En este ensayo, se introdujo un par de crRNA para iniciar la detección dual CRISPR-Cas12a y mejorar la sensibilidad de detección. Se utilizó con éxito para detectar ácidos nucleicos (ADN y ARN) de SARS-CoV-2 y VIH con una sensibilidad de pocas copias.

Además, se evaluó detectando el ARN del VIH-1 extraído de muestras de plasma humano, logrando una sensibilidad comparable con el método de RT-PCR en tiempo real. Por lo tanto, tiene un gran potencial para desarrollar diagnósticos moleculares point of care de próxima generación.

En otro trabajo se lleva a cabo la amplificación isotérmica combinada con tecnología CRISPR-Cas12 DETECTR 121 para desarrollar una prueba rápida (~ 30 min) y de bajo costo para la detección de SARS-CoV-2 en muestras clínicas.
medrxiv.org/content/medrxi…

Las ventajas clave de este nuevo enfoque sobre métodos existentes, como qRT-PCR, incluyen:
1) amplificación de señal isotérmica para la detección rápida de objetivos que evita la necesidad de termociclado...

2) especificidad de un solo nucleótido de objetivo (los ARN guía en el sitio N2 pueden distinguir el SARS -CoV-2 de SARS-CoV y MERS-CoV),
3) integración con formatos de informes portátiles y de bajo costo, como tiras de flujo lateral y...

4) ciclo de desarrollo rápido para abordar las amenazas emergentes de los nuevos 132 virus zoonóticos (<2 semanas para SARS-CoV-2).

El proyecto europeo CONVAT, del CSIC en el Instituto Catalán de Nanociencia y Nanotecnología (ICN2), desarrollará...

…una plataforma de punto de atención para el diagnóstico rápido y el monitoreo del coronavirus. El dispositivo biosensor también permitiría el análisis de diferentes tipos de coronavirus presentes en animales de reservorio, como los murciélagos…

…para monitorear la evolución de estos virus y prevenir futuros brotes infecciosos en humanos.
icn2.cat/en/news/4466-t…

Esto es todo. Espero que os haya gustado. Para nosotros ha sido un gran placer hacerlo y nos vemos la semana que viene. @Raquiglam.

P.D: Ignacio (@microBIOblog) espero que no te haya importado que cogiera 2 o 3 imágenes tuyas, estaban muy bien...😜