Thread by @ligero999

#HilosMicrobiología. Hoy os haré una introducción sobre la secuenciación masiva y sus posibles aplicaciones en microbiología. Es un tema que me parece fascinante y del cual sé poco, así que me puse a investigar un poco. Lo voy a dividir en dos hilos, porque el tema es denso.

En el primer hilo (éste), os contaré los principios de la secuenciación y los métodos de secuenciación de 1ª generación: método de Sanger y pirosecuenciación.

En el segundo, os hablaré de los métodos de secuenciación de 2ª generación, los de 3ª gen y las aplicaciones en micro.

Bien, empecemos. ¿ Qué es secuenciar? Secuenciar una molécula de DNA consiste en determinar en qué orden se disponen los cuatro nucleótidos que componen la molécula.

El primer método diseñado para secuenciar el DNA fue desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert en 1976.

Es un método químico que somete la molécula de DNA a distintos métodos de ruptura. Cada método escinde la molécula allí donde haya un nucleótido específico. Es bastante laborioso y, hoy en día, ha sido sustituido por métodos enzimáticos.

El método de Sanger fue diseñado por Fred Sanger en 1977. También se conoce como método didesoxi o secuenciación por terminación de la cadena.
-Se terminó imponiendo por ser más sencillo y preciso.
-Se basa en el uso de didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs)...

...los cuales carecen de un grupo 3’-OH en la desoxirribosa.
-De este modo, al entrar en contacto con la DNA-polimerasa ésta no puede enlazar otros nucleótidos al ddNTP.

Para el método de Sanger se necesitan los siguientes componentes:
1) Un DNA de cadena sencilla (molde)

2) Un cebador para iniciar la síntesis de DNA.
3) Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato marcados con fluorescencia o radioactividad.
4) La enzima DNA-polimerasa
5) Los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) que son utilizados...

...por la DNA polimerasa para construir la nueva hebra pero, una vez incorporados, impiden la adición de nuevos nucleótidos.

Veamos los pasos:
1) Se llevan a cabo cuatro reacciones distintas en tubos diferentes. Cada uno con un ddNTP distinto.

2) El cebador, por complementariedad, se une a la hebra molde favoreciendo su reconocimiento por la DNA polimerasa y el inicio de la síntesis de la nueva hebra.

3) La DNA polimerasa va añadiendo dNTPs hasta que de forma aleatoria, incorpora el ddNTP, entonces se para la reacción

4) A continuación, el contenido de cada uno de los tubos se corre en carreras diferentes de un gel de acrilamida.

5) Por diferencia de tamaños, se puede determinar la disposición de la secuencia complementaria a la molde, y de ahí la secuencia original.

Este proceso, actualmente, se ha mejorado y se ha automatizado de 3 maneras:
1) Los ddNTP terminadores de cadena están marcados fluorescentemente. Cada ddNTP se marca con un fluoróforo distinto. De este modo, la reacción se lleva a cabo en un sólo tubo.

2) Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible automatizar el proceso como si se tratara de una PCR.
3) La separación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es más rápida que la electroforesis en gel.

Los fragmentos de distintos tamaños llegan al final del capilar, donde son excitados con un láser y se detecta la fluorescencia emitida por el ddNTP terminal.
El gráfico resultante se denomina electroferograma.

Bien, hablemos ahora de la pirosecuenciación.
Descripta en 1985 por Pal Nyrén, la técnica consta de una serie de pasos enzimáticos y basa su detección en cuantificar la señal luminosa emitida tras la incorporación de un nucleótido a la cadena a secuenciar y la consecuente...

...liberación de pirofosfato inorgánico.
Esta técnica es fundamental en el desarrollo de la secuenciación 454 posterior, una NGS producida por 454 Life Sciences en 2005 y absorbida en 2007 por Roche.
Se necesitan los siguientes componentes:
-Un DNA de cadena sencilla (molde)

-Un cebador para iniciar la síntesis de DNA
-Tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S, un derivado del dATP que puede ser utilizado normalmente por la DNA-polimerasa pero que no es reconocido...

...por la luciferasa).
-Cuatro enzimas: DNA polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa.
-Adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
-Luciferina.

Bien, veamos el proceso:

1) El DNA molde hibridará con un cebador. En el tubo de reacción se encontrarán las enzimas...

...luciferasa, ATP sulfurilasa, DNA polimerasa y apirasa además de los sustratos luciferina y adenosín-5-fosfosulfato (APS).
2) A continuación se añaden los nucleótidos uno a uno.
3) Si el nucleótido corresponde al que necesita la polimerasa, se incorpora a la cadena...

...y se libera un pirofosfato.
4) Posteriormente, una ATP sulfurilasa en presencia del APS transforma este pirofosfato (PPi) en ATP , que se acoplará a la luciferina, produciendo oxiluciferina y una señal luminosa de intensidad proporcional al número de nucleótidos incorporados.

El secuenciador captura esta señal lumínica y lo reproduce como un pico en un pirograma.
5) Finalmente, una apirasa se encarga de degradar aquellos nucleótidos que no han sido incorporados para que no interfieran en la sig. reacción.
6) De esta forma se puede deducir...

...la secuencia partiendo del tamaño de los picos obtenidos.

Hasta aquí el primer hilo. Ahora os colgaré el segundo.

Aquí os dejo el segundo hilo:

https://twitter.com/ligero999/status/1384983859972947978?s=20