Thread by @ligero999

#HilosMicrobiología. Este es el segundo hilo sobre la secuenciación masiva. Aquí os hablaré de los New Generation Sequencing (NGS) (secuenciadores de 2ª gen), los de tercera y las posibles aplicaciones en microbiología. Empecemos.

La secuenciación denominada NGS, es considerada la segunda generación en lo que respecta a la secuenciación del DNA. Es un grupo de tecnologías diseñadas para secuenciar gran cantidad de segmentos de DNA de forma masiva y en paralelo, en menor cantidad de tiempo...

...y a un menor costo por base. Surgieron a partir de 2005.

Todas las técnicas NGS siguen un abordaje metodológico semejante que se puede resumir en 5 pasos:
1) segmentación del DNA en varios fragmentos de distintos tamaños (creación de librerías).

2) marcaje del DNA por medio de primers o adaptadores que indican el punto de partida para la replicación.
3) amplificación de los fragmentos de DNA marcados con adaptadores por métodos basados en PCR.
4) secuenciación o lectura de los fragmentos de DNA y…

5) reconstrucción de la secuencia completa por medio de secuencias de referencia y exportación a ficheros de almacenamiento de datos.
Los principales métodos de NGS son:
1) Pirosecuenciación (secuenciación 454 Roche)
2) Secuenciación por síntesis (Illumina)

3) Secuenciación por ligación (Ion Torrent y SOLID).

Voy a hablar brevemente de cada uno de ellos.
1) SECUENCIACIÓN POR LIGACIÓN (SoLiD)
Sus siglas vienen del inglés Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection.

Introducido en el mercado en 2007 por Life Technologies y ya descatalogado por su alta tasa de errores y porque incrementa notablemente su error cuando en el DNA hay secuencias palindrómicas por la formación de horquillas. Además no secuencia más de 50 pb.

Os dejo unas diapositivas hechas por mí sobre este método, porque explicar el procedimiento sería muy engorroso por Twitter. De todas formas, en el siguiente tweet tenéis un vídeo donde se explica de maravilla.

Entender el procedimiento de como funciona no es nada fácil, pero encontré un vídeo dónde los explican de una manera que se entiende todo. Las imágenes del twwet anterior las saqué de su vídeo... Os lo dejo para los curiosos:

2) SECUENCIACIÓN POR SÍNTESIS EN CLUSTERS: ILLUMINA.

Apareció en 2006 por la empresa Solexa, actualmente Illumina.

La tecnología Illumina es la que se haya más extendida en el ámbito clínico dado que su alto rendimiento y la precisión de las lecturas generadas...

...la hacen idónea para la mayoría de las aplicaciones de la secuenciación masiva en Microbiología Clínica.

El procedimiento de cómo funciona tampoco es fácil, pero con este vídeo se entiende perfectamente (en inglés):

Aquí os dejo unas diapositivas hechas por mi también sobre este método. La explicación sería muy engorrosa. Las imágenes las saqué del vídeo anterior también.

3) SECUENCIACIÓN 454 ROCHE:
Es una variante de la pirosecuenciación descrita por Jonathan Rodberg y colaboradores de la empresa 454 Life Sciences en 2005. En 2013 la plataforma de secuenciación 454 dejó de ser competitiva y la compañía Roche...

...que había adquirido 454 Life Science en 2007, decidió dejar de comercializarla.

Os dejo también unas diapos hechas por mi:

4) SECUENCIACIÓN ION TORRENT:
Fue desarrollada por Ion Torrent Systems Inc. y salió al mercado en febrero de 2010. Ion Torrent patrocinó la máquina como un secuenciador rápido, compacto y económico que se puede utilizar en un gran número de laboratorios como un aparato de mesa.

Os dejo también unas diapos hechas por mi:

Bien, una vez explicados los NGS, voy a pasar a explicar brevemente los secuenciadores de tercera generación:
En los últimos años se han desarrollado las técnicas de secuenciación de 3ª generación, las cuales han venido a paliar algunos de los defectos de las tecnologías...

...precedentes: el tamaño de las lecturas y el uso directo de la muestra de ácidos nucleicos sin amplificar.
Entre sus características generales está la generación de lecturas de gran tamaño, una secuenciación monitorizada a tiempo real y no necesitan la amplificación previa...

...de los ácidos nucleicos, siendo capaces de detectar modificaciones químicas de las bases nitrogenadas tanto de ADN como de ARN.

A pesar de estas ventajas, presentan tres grandes inconvenientes.
1) La cantidad de lecturas (cobertura) que pueden generar sigue siendo...

...muy reducida en comparación con las que producen las tecnologías de secuenciación de segunda generación.
2) El segundo problema de estas tecnologías es su menor fidelidad, siendo las tasas de acierto de hasta un 99,8% para PacBio y hasta un 95% para Oxford Nanopore.

3) El coste del aparataje no sale rentable.

Un breve resumen de los secuenciadores en el mercado y su potencia de lectura queda reflejada en la siguiente imagen:

Por último, me gustaría poner las aplicaciones principales en Microbiología, que son unas cuantas y que cada vez se está utilizando más. Queda resumido en lo siguiente:
-diagnóstico de enfermedades infecciosas,mecanismos de resistencia a antibióticos, genes de virulencia...

...abordaje de brotes, epidemiología global etc.

Además de en Microbiología, se están utilizando en otras ramas tb, como la veterinaria, estudio de enfermedades autoinmunes etc.

A continuación os dejo la bibliografía.

Por supuesto, soy un novato en este tema, cualquier cosa, sugerencia, comentario que me haga mejorar y entender mejor la secuenciación masiva os estaré agradecido. Un saludo a todos.

Bibliografía:
-pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18576944/
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-researchgate.net/publication/32…
-ehu.eus/biofisica/juan…
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-revistas.javeriana.edu.co/files-articulo…