Thread by @FPFabrizioPhD

Come si studiano le alterazioni molecolari delle cellule tumorali? E qual è il percorso di un campione biologico? In più, il ruolo della "biopsia liquida". Partiamo con il thread. Sarà lungo e mi auguro molto interessante. Seguitemi. Let's go! 1/n 🧵
#oncologia #nonsolocovid

Le alterazioni molecolari delle cellule tumorali si studiano partendo essenzialmente dall’allestimento di un preparato biologico. Che sia chiaro. Ma andando nel dettaglio, vediamo come avviene. 2/n

Prima di tutto i pezzi chirurgici o biopsie devono essere fissati in formalina (agenti chimici e fisici denaturano le proteine nel tessuto) e inclusi in paraffina. 3/n

Quest'ultima è utile per la preparazione dei blocchetti di materiale, miscela di idrocarburi saturi ad elevato peso molecolare, insolubili sia in acqua che in etanolo, per poter essere sottoposti poi al taglio con il microtomo. 4/n

L’esame istologico è volto alla definizione della patologia dei tessuti a scopo di diagnosi e cura e la sua esecuzione impone dei tempi minimi per ottenere il prodotto finale (vetrino istologico) e può essere necessario ricorrere a tecniche definite di immunoistochimica. 5/n

Quest'ultima consiste in una serie di procedure che attraverso la reazione antigene/anticorpo permette di individuare al microscopio la sede di espressione o assenza di espressione di antigeni tissutali/cellulari per un quadro diagnostico più chiaro. 6/n

Il materiale sottoposto ad esame istologico è costituito da frammenti di tessuti (biopsie) o da organi o loro parti asportati attraverso un intervento chirurgico (resezione). 7/n

L’esame citologico è volto alla definizione della natura delle cellule prelevate. Il materiale sottoposto a esame citologico è costituito da cellule esfoliate, agoaspirate o asportate per abrasione da tessuti di organi o cavità ottenute da liquido biologico o agoaspirato. 8/n

Es. le sezioni colorate con ematossilina- eosina, una colorazione istomorfologica, permettono di distinguere con due coloranti il nucleo dalla struttura citoplasmatica. 9/n

Quello che è davvero importante è avere dei campioni puri ed omogenei, un requisito fondamentale per le analisi molecolari, sia qualitative che quantitative. 10/n

In virtù di questa esigenza, i tessuti sia inclusi in paraffina sono stati tagliati al microtomo e colorati con la colorazione Ematossilina-Eosina, vengono sottoposte ad una attenta analisi al microscopio ottico da parte del patologo. 11/n

Questa operazione è necessaria per individuare e selezionare l’area del vetrino contenente le cellule tumorali e scartare eventuale tessuto necrotico, flogistico e sano. 12/n

Se nella sezione del vetrino non vi sono abbastanza cellule tumorali viene macrodissecata ovvero arricchita in maniera tale da partire con una giusta quantità di cellule tumorali per l’analisi molecolare. 13/n

Viene grattata tale sezione paraffinata da cui successivamente è possibile estrarre, purificare e amplificare il DNA applicando tecniche di sequenziamento al fine di discriminare eventuali alterazioni genetiche di quel paziente. 14/n

Sebbene le alterazioni genetiche e le analisi di mutazioni correlate a patologie tumorali siano già da tempo studiate e finalizzate alla diagnosi risultando fondamentali per l’orientamento prognostico e terapeutico del paziente. 15/n

Nell’ambito della pratica clinica un nuovo importante ruolo è rivestito dalla cosiddetta “biopsia liquida”, una metodica che consente di ottenere informazioni relative alle possibili modificazioni genetiche del tumore e di monitorarne la sua evoluzione. 16/n

Il DNA tumorale circolante porta in se le caratteristiche patologiche del tumore originale come ad es. le mutazioni puntiformi, variazione del numero di copie, riarrangiamenti genici. 17/n

Il DNA tumorale circolante è una frazione del DNA libero circolante diffusa nel sistema circolatorio. 18/n

Il DNA tumorale circolante può entrare nel flusso sanguigno attraverso la secrezione diretta delle cellule tumorali vitali come DNA libero circolante come vescicole dette esosomi o in seguito a processi di apoptosi o necrosi delle cellule tumorali. 19/n

Esso rappresenta un marker ideale per la genotipizzazione del tumore e per la descrizione del profilo molecolare dello stesso tumore in esame. 20/n

Quindi, cosa accade? Il DNA tumorale circolante viene processato ad opera dei macrofagi che inglobano queste cellule tumorali e rapidamente rilasciato nel sangue sotto forma di piccoli detriti cellulari. 21/n

Ovviamente la quantità di DNA tumorale circolante può essere differente in relazione al carico mutazionale e varia in base alla differente presentazione clinica del paziente. 22/n

A partire da un semplice prelievo di sangue il quale viene immediatamente centrifugato è possibile ottenere il plasma da cui si estrae il DNA tumorale circolante che verrà successivamente sottoposto ad analisi di quantificazione. 23/n

La composizione dopo centrifugazione del plasma sarà acqua maggiormente, proteine, metaboliti e DNA libero circolante in tracce; e delle componenti cellulari quali globuli bianchi 2-3%, piastrine 2-3%, globuli rossi (90%) e infine tracce di cellule tumorali circolanti. 24/n

A differenza della biopsia tissutale che rappresenta una procedura invasiva e fornisce una fotografia “istantanea” del tumore, nel sito del prelievo e nel momento del prelievo stesso
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La biopsia liquida può essere ripetuta più volte con un impatto minimo in termini di invasività ma soprattutto utilizzata per il monitoraggio dei pazienti in corso di terapia nei quali non è possibile ripetere il prelievo o accedere direttamente al tessuto. 26/n

La biopsia liquida consente di individuare un gruppo di pazienti che progrediranno velocemente rispetto ad altri che presentano una malattia meno aggressiva. Inoltre può trovare grande utilità anche nella terapia a bersaglio molecolare. 27/n

Ad esempio valutando la presenza di cellule/cloni resistenti ai farmaci ed avviando nuove ipotesi scientifiche allo scopo di chiarire al meglio le vie di segnalazione implicate nei processi di invasività cellulare e metastatizzazione dei tumori primitivi. 28/n

Nonostante la biopsia liquida abbia un grande potenziale ed effetto predittivo sulla progressione di un tumore, vi sono alcuni limiti: quantità di ctDNA nel plasma scarsa a seconda del tipo di tumore analizzato, dello stadio tumorale (localizzato o diffuso) e del grado. 29/n

Infine, con la biopsia liquida e le terapie biologiche nasce l’esigenza di capire come migliorare il percorso diagnostico e terapeutico del paziente 30/n

L'obiettivo è facilitare lo sviluppo di nuove strategie di gestione non invasive del tumore e poter quindi stabilire il trattamento personalizzato più efficace e quindi ad personam. 31/n

Fonti:
tandfonline.com/doi/abs/10.108…
link.springer.com/book/10.1007/9…
cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/11/4/8…
futuremedicine.com/doi/10.2217/lm…
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E grazie per essere arrivati fin qui!